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作者：王美玲 林達(dá)劉知識(shí)產(chǎn)權(quán)
原標(biāo)題：CRISPR專(zhuān)利申請(qǐng)淺析
CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年，研究者在大腸桿菌的基因組中首次發(fā)現(xiàn)了這一奇特的重復(fù)間隔序列，隨后在細(xì)菌和古細(xì)菌中被大量發(fā)現(xiàn)。在CRISPR技術(shù)快速發(fā)展的同時(shí)，其專(zhuān)利權(quán)的糾紛也隨之而來(lái)。目前，圍繞CRISPR核心專(zhuān)利的權(quán)利紛爭(zhēng)尚未定論，而加州大學(xué)與維也納大學(xué)團(tuán)隊(duì)以及Broad研究所團(tuán)隊(duì)已經(jīng)分別將CRISPR相關(guān)專(zhuān)利授權(quán)給多家生物、醫(yī)藥公司；在CRISPR核心專(zhuān)利的權(quán)利歸屬明確后，勢(shì)必有一些引進(jìn)單方團(tuán)隊(duì)專(zhuān)利的公司將面臨巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
1、背景
CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年，研究者在大腸桿菌的基因組中首次發(fā)現(xiàn)了這一奇特的重復(fù)間隔序列[1]，隨后在細(xì)菌和古細(xì)菌中被大量發(fā)現(xiàn)。2002年科學(xué)家才將其命名為成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。
CRISPR/Cas系統(tǒng)是大部分細(xì)菌和古細(xì)菌中用來(lái)對(duì)抗外來(lái)核酸/噬菌體入侵的一種免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)最典型的特征是由CRISPR系統(tǒng)相關(guān)蛋白(Cas)，重復(fù)序列(repeats)，間隔序列(spacer)組成，重復(fù)序列和間隔序列交替排列。當(dāng)病毒首次入侵時(shí)， 細(xì)菌會(huì)將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區(qū)；病毒再次入侵時(shí)，CRISPR轉(zhuǎn)錄、加工形成crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識(shí)別后，介導(dǎo)Cas蛋白結(jié)合并切割，從而對(duì)抗外源核酸入侵。
(CRISPR-CAS系統(tǒng)的自適應(yīng)免疫[2])
CRISPR系統(tǒng)根據(jù)基因的保守性和基因座的組織形式分為了三種類(lèi)型，即Type I，Type II和Type III型[3]，每個(gè)類(lèi)型中又可以分為幾種小類(lèi)。目前廣泛應(yīng)用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于2類(lèi)Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，僅由crRNA、tracrRNA和Cas9三種成分組成。根據(jù)tracrRNA與crRNA的結(jié)構(gòu)特性，科學(xué)家們將tracrRNA和crRNA組合為一條嵌合的向?qū)NA(guide RNA，gRNA)，使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步簡(jiǎn)化為只有g(shù)RNA和Cas9這2種組分的系統(tǒng)。
CRISPR/Cas系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于基因治療、轉(zhuǎn)基因生物構(gòu)建、藥物篩選等多個(gè)領(lǐng)域，推動(dòng)了生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。2020年3月，Editas Medicine和Allergan 共同宣布，臨床試驗(yàn)完成了首例患者體內(nèi)給藥，其療法AGN-151587也是全球首款在患者體內(nèi)給藥的CRISPR基因編輯療法。
2、CRISPR技術(shù)專(zhuān)利申請(qǐng)趨勢(shì)
2.1 申請(qǐng)數(shù)量
CRISPR技術(shù)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，專(zhuān)利申請(qǐng)一直處于緩慢發(fā)展的階段。2012年，Jennifer Doudna與Emmanuelle Charpentier合作，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)簡(jiǎn)單的CRISPR/Cas系統(tǒng)，它通過(guò)Cas9核酸內(nèi)切酶以及以CRISPR序列為模板轉(zhuǎn)錄出來(lái)的兩種RNA就可以剪切dsDNA，將CRISPR/Cas9 改造成為可高效實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)修飾靶基因特定DNA序列的工具。自此，CRISPR作為新生代的基因編輯技術(shù)，其研究熱潮迅速席卷全球，專(zhuān)利申請(qǐng)數(shù)量也大幅度攀升。
(CRISPR專(zhuān)利申請(qǐng)量變化[4])
2.2 主要申請(qǐng)人
目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)的主要研發(fā)團(tuán)隊(duì)包括Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier、張峰等，其中Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier首次提出了CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)DNA的靶向編輯功能，并進(jìn)行相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)；隨后張鋒等率先開(kāi)發(fā)出了可在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)，并且及時(shí)申請(qǐng)了專(zhuān)利。
自此之后，張鋒課題組又先后發(fā)現(xiàn)了新型基因編輯工具CRISPR/Cas12a(舊稱(chēng)CRISPR/Cpf1)，具有較高的基因編輯能力；同年，張峰課題組發(fā)布了來(lái)自于細(xì)菌的CRISPR/C2c2系統(tǒng)，后命名為CRISPR/Cas13a系統(tǒng)，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)RNA有剪切功能。
CRISPR技術(shù)的全球?qū)＠饕暾?qǐng)人可見(jiàn)表1，其中麻省理工學(xué)院、哈佛大學(xué)、博德研究所為主要申請(qǐng)人，張峰作為Broad研究所(Broad Institute)教授，并創(chuàng)辦了Editas Medicine公司，其對(duì)CRISPR相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)量遠(yuǎn)高于其他發(fā)明人。
2.3 技術(shù)領(lǐng)域
CRISPR相關(guān)專(zhuān)利的應(yīng)用領(lǐng)域涵蓋醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)領(lǐng)域，其應(yīng)用范圍廣，其中醫(yī)學(xué)是最大的應(yīng)用領(lǐng)域，包括遺傳、癌癥等疾病治療，以及新藥開(kāi)發(fā)等相關(guān)領(lǐng)域。在申請(qǐng)技術(shù)領(lǐng)域方面，如下IPC分類(lèi)中占據(jù)比較大的申請(qǐng)比例：C12N9/22(核糖核酸酶)、C12Q1/68(包括核酸)、C12N15/113(調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼核酸，如反義寡核苷酸)，以及A61K48/00(含有插入到活體細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)以治療遺傳病的醫(yī)藥配制品；基因治療)、C12N15/90(將外來(lái)DNA穩(wěn)定地引入染色體中)、C12N15/85(用于動(dòng)物細(xì)胞)等。目前，CRISPR相關(guān)專(zhuān)利多關(guān)注于Cas蛋白改造，gRNA設(shè)計(jì)、基因結(jié)構(gòu)改造、定向修飾，基因表達(dá)調(diào)控等。
2.4 技術(shù)主題
CRISPR相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)具有主題類(lèi)型豐富、可布局方式多樣等特點(diǎn)，下圖示出了目前CRISPR專(zhuān)利申請(qǐng)中主要的技術(shù)主題類(lèi)型：
(CRISPR專(zhuān)利申請(qǐng)主題)
Cas蛋白與gRNA是CRISPR專(zhuān)利申請(qǐng)中占比最高的兩類(lèi)技術(shù)主題。在涉及Cas蛋白的專(zhuān)利申請(qǐng)中，以Cas9蛋白為技術(shù)主題的專(zhuān)利申請(qǐng)占據(jù)主要的申請(qǐng)比例，此外以新發(fā)現(xiàn)的Cas12a、Cas13等Cas蛋白為技術(shù)主題的申請(qǐng)量也逐漸增多。其中，由于Cas12a蛋白與crRNA、目標(biāo)核酸鏈結(jié)合后，可釋放對(duì)ssDNA的切割活性，拓展了CRISPR技術(shù)在核酸檢測(cè)領(lǐng)域的專(zhuān)利申請(qǐng)。
利用Cas蛋白的核酸酶活性部分喪失或全部喪失的突變體（例如，Cas9n、dCas9等）開(kāi)發(fā)有一系列新型的編輯系統(tǒng)，例如Cas9n、dCas9與脫氨酶等蛋白融合，可用于構(gòu)建對(duì)單堿基編輯的堿基編輯器。在以堿基編輯器為技術(shù)主題的專(zhuān)利申請(qǐng)中，哈佛大學(xué)、Broad研究所、比姆醫(yī)療公司等占據(jù)申請(qǐng)優(yōu)勢(shì)。
gRNA或crRNA、tracrRNA是構(gòu)成CRISPR系統(tǒng)的重要內(nèi)容，gRNA、crRNA、tracrRNA的優(yōu)化與設(shè)計(jì)對(duì)于改善脫靶率、改良編輯效率等具有積極作用，是CRISPR專(zhuān)利申請(qǐng)中的另一長(zhǎng)期布局重點(diǎn)。
2.5 專(zhuān)利糾紛
在CRISPR技術(shù)快速發(fā)展的同時(shí)，其專(zhuān)利權(quán)的糾紛也隨之而來(lái)。2012年5月，加州大學(xué)的Jennifer Doudna等提交了關(guān)于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的專(zhuān)利申請(qǐng)，同時(shí)在申請(qǐng)中描述了CRISPR/Cas9在細(xì)菌等原核生物中的應(yīng)用情況。2012年12月，張鋒基于真核細(xì)胞內(nèi)的CRISPR/Cas9技術(shù)申請(qǐng)專(zhuān)利，雖然申請(qǐng)時(shí)間較前者晚7個(gè)月，但張鋒所在的Broad研究所通過(guò)專(zhuān)利申請(qǐng)加速程序于2014年4月15日優(yōu)先通過(guò)專(zhuān)利審查，首次獲得CRISPR/Cas9的專(zhuān)利授權(quán)。
2016年，加州大學(xué)以“專(zhuān)利沖突”為由，針對(duì)Broad研究所的CRISPR基因編輯專(zhuān)利，以及另外11件相關(guān)專(zhuān)利向美國(guó)專(zhuān)利商標(biāo)局專(zhuān)利審判和上訴委員會(huì)(PTAB)請(qǐng)求啟動(dòng)抵觸審查程序，以確認(rèn)誰(shuí)先發(fā)明了CRISPR基因編輯技術(shù)。2017年，PTAB認(rèn)為方專(zhuān)利不存在事實(shí)上的干擾，雙方持有的專(zhuān)利涉及不同主題的發(fā)明，判定雙方保留各自專(zhuān)利。隨后，加州大學(xué)正式向聯(lián)邦巡回上訴法院(CAFC)遞交上訴，指出因編輯原始應(yīng)用覆蓋了所有細(xì)胞、植物、動(dòng)物和人類(lèi)，不止局限于細(xì)菌。2018年9月份，CAFC最后裁定維持美國(guó)專(zhuān)利審判與上訴委員會(huì)的判決，Broad研究所將繼續(xù)擁有在真核生物中使用CRISPR基因編輯的知識(shí)產(chǎn)權(quán)[5]。
2022年2月4日，PTAB進(jìn)行了專(zhuān)利聽(tīng)證會(huì)，雙方就Broad研究所是否以不正當(dāng)方式獲取CRISPR的早期技術(shù)信息，以及用于真核細(xì)胞中編輯的gRNA的歸屬問(wèn)題展開(kāi)爭(zhēng)論，但目前尚未給出定論。
3、總結(jié)
目前，圍繞CRISPR核心專(zhuān)利的權(quán)利紛爭(zhēng)尚未定論，而加州大學(xué)與維也納大學(xué)團(tuán)隊(duì)以及Broad研究所團(tuán)隊(duì)已經(jīng)分別將CRISPR相關(guān)專(zhuān)利授權(quán)給多家生物、醫(yī)藥公司；在CRISPR核心專(zhuān)利的權(quán)利歸屬明確后，勢(shì)必有一些引進(jìn)單方團(tuán)隊(duì)專(zhuān)利的公司將面臨巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
因此，如何圍繞CRISPR/Cas技術(shù)的核心改進(jìn)點(diǎn)，結(jié)合外圍專(zhuān)利策略，在CRISPR 系統(tǒng)、Cas蛋白、gRNA、PAM及相關(guān)方法、應(yīng)用等方面進(jìn)行全面考量，合理統(tǒng)籌、布局，是未來(lái)CRISPR/Cas技術(shù)研發(fā)、商業(yè)應(yīng)用過(guò)程中需要考慮的重要問(wèn)題。
參考文獻(xiàn)：
[1]Y Ishino, H Shinagawa, K Makino, M Amemura, A Nakata . Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product. J Bacteriol. 1987 Dec; 169(12):5429-33.
[2]Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-1278.
[3]Makarova KS, Haft DH, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Wolf YI, Yakunin AF, van der Oost J, Koonin EV. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 2011. Jun;9(6):467-77.
[4]https://www.ipstudies.ch/crispr-patent-analytics/
[5]何雋,張虹穎. 專(zhuān)利訴訟與研發(fā)活動(dòng)對(duì)科技公司影響的實(shí)證研究[J]. 科技管理研究, 2020, 40(6).
來(lái)源：IPRdaily中文網(wǎng)（iprdaily.cn）
作者：王美玲 林達(dá)劉知識(shí)產(chǎn)權(quán)
編輯：IPRdaily王穎 校對(duì)：IPRdaily縱橫君
注：原文鏈接：CRISPR專(zhuān)利申請(qǐng)淺析（點(diǎn)擊標(biāo)題查看原文）
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